直接PCR（Direct PCR）是一種不經(jīng)核酸提取而直接使用動(dòng)物或植物組織等直接進(jìn)行擴(kuò)增的反應(yīng),。在許多方面，直接PCR的工作方式類似于常規(guī)PCR,。
主要區(qū)別是直接PCR中使用的定制緩沖液,，樣本可不經(jīng)過(guò)核酸抽提，直接進(jìn)行PCR反應(yīng),，但對(duì)于參與直接PCR反應(yīng)的酶的耐受性和buffer的兼容性有相對(duì)應(yīng)的要求,。
盡管常見的樣品中或多或少都會(huì)存在PCR抑制劑，但在酶和buffer的作用下直接PCR仍可實(shí)現(xiàn)可靠的擴(kuò)增,。而傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)需要以高質(zhì)量的核酸為模板進(jìn)行反應(yīng),，如模板中含有蛋白以及其他雜質(zhì)時(shí)就會(huì)抑制PCR反應(yīng)的順利進(jìn)行。直接PCR是目前分子診斷領(lǐng)域比較熱門的技術(shù)之一,。
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直接PCR最初用于動(dòng)植物
直接PCR最早應(yīng)用的領(lǐng)域是動(dòng)植物領(lǐng)域,，比如鼠、貓,、雞,、兔、羊,、牛等動(dòng)物的血液,、組織和毛發(fā)；植物的葉片和種子等,，用來(lái)研究基因分型,、轉(zhuǎn)基因、質(zhì)粒檢測(cè)、基因敲除分析,、DNA來(lái)源鑒定,、物種鑒定、SNP分析等領(lǐng)域,。
這些領(lǐng)域有一些共同的特點(diǎn),，那就是目標(biāo)基因的含量比較高，核酸提取麻煩,，所以直接PCR不僅能夠節(jié)省時(shí)間,，對(duì)結(jié)果的影響很小，同時(shí)也能節(jié)省成本,。
直接PCR用于病原體檢測(cè),，是近幾年的事，部分PCR試劑廠商在做創(chuàng)新的時(shí)候朝著這個(gè)方向做了很多的努力,，尤其是這次新冠疫情,，市場(chǎng)上出現(xiàn)了很多這樣的檢測(cè)產(chǎn)品！
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直接PCR需要的試劑
樣本裂解液
樣本裂解液可以自己配置,，也可以購(gòu)置,。不同品牌裂解液組份的差異會(huì)使得裂解能力各有不同，進(jìn)而裂解時(shí)間稍有差異,。比如說(shuō)動(dòng)物組織樣本制備,，一般推薦30min或過(guò)夜裂解，針對(duì)病毒類的裂解液在3-10min不等,。
PCR master mix
建議使用熱啟動(dòng)DNA聚合酶,，增強(qiáng)特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增能力也更強(qiáng),。直接PCR的核心就是具有高度耐受的聚合酶,。
清除或抑制樣本中影響DNA擴(kuò)增的組份
樣本在經(jīng)過(guò)裂解液處理之后，會(huì)釋放出蛋白質(zhì),、脂質(zhì)和其他細(xì)胞碎片,，這些物質(zhì)會(huì)抑制PCR反應(yīng)，因此直接PCR需要加入相應(yīng)的清除或者抑制劑來(lái)減弱這部分因素的影響,。
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直接PCR五大知識(shí)點(diǎn)薈萃
第一,、Direct PCR技術(shù)是針對(duì)各類生物樣品的直接PCR技術(shù)。該技術(shù)條件下,，無(wú)需對(duì)核酸進(jìn)行分離提取,，直接以組織樣本為對(duì)象，加入目標(biāo)基因引物進(jìn)行PCR反應(yīng),。
第二,、Direct PCR技術(shù)不僅僅是傳統(tǒng)的DNA模版的擴(kuò)增技術(shù),，也包含RNA模版的逆轉(zhuǎn)錄PCR。
第三,、Direct PCR技術(shù)不僅僅是直接對(duì)組織樣本進(jìn)行常規(guī)定性PCR反應(yīng),，還包括Real-Time qPCR反應(yīng)，這就要求反應(yīng)體系具備極強(qiáng)的抗背景熒光干擾能力以及對(duì)內(nèi)源性熒光淬滅劑的拮抗能力,。
第四,、Direct PCR技術(shù)針對(duì)的樣本，只需要核酸模版的釋放,，并不對(duì)干擾PCR反應(yīng)的蛋白,、多糖、鹽離子等進(jìn)行去除,，這要求反應(yīng)體系中的核酸聚合酶和PCR Mix具有極佳的抗逆性和適應(yīng)性,，能夠在復(fù)雜的條件下保證酶活性和復(fù)制準(zhǔn)確性。
第五,、Direct PCR技術(shù)針對(duì)的組織樣品未經(jīng)任何核酸富集處理,，模版量極少，這就要求反應(yīng)體系有極高的靈敏度和擴(kuò)增效率,。
參考資料：翊圣生物,、賽默飛生命科學(xué)等
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